Anche buone modifiche genetiche possono andare male

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immagine: i ricercatori della Rice University stanno conducendo uno sforzo per rivelare potenziali minacce all’efficacia dell’editing genetico CRISPR-Cas. Da sinistra, Julie Park, Lavanya Saxena, Mingming Cao e Gang Bao.
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Credito: Jeff Fitlow/Rice University

HOUSTON – (24 ottobre 2022) – Un laboratorio della Rice University è lo sforzo di rivelare potenziali minacce all’efficacia e alla sicurezza delle terapie basate su CRISPR-Cas9, la tecnica di editing genetico vincitrice del Premio Nobel, anche quando sembra funzionare come programmato.

Il bioingegnere Gang Bao della George R. Brown School of Engineering della Rice e il suo team sottolineano in un articolo pubblicato su Science Advances che mentre le modifiche fuori bersaglio al DNA sono state a lungo motivo di preoccupazione, anche le modifiche invisibili che accompagnano le modifiche al bersaglio devono essere da riconoscere — e quantificare.

Bao ha notato che un documento sulla biotecnologia della natura del 2018 indicava la presenza di grandi cancellazioni. “In quel momento abbiamo iniziato a esaminare cosa possiamo fare per quantificarli, grazie ai sistemi CRISPR-Cas9 progettati per il trattamento dell’anemia falciforme”, ha affermato.

Bao è stato un forte sostenitore del CRISPR-Cas9 come strumento per il trattamento dell’anemia falciforme, una ricerca che ha portato lui e i suoi colleghi sempre più vicini a una cura. Ora i ricercatori temono che grandi delezioni o altri cambiamenti non rilevati dovuti all’editing genetico possano persistere nelle cellule staminali mentre si dividono e si differenziano, quindi avere implicazioni a lungo termine per la salute.

“Non abbiamo una buona comprensione del motivo per cui alcune migliaia di basi di DNA nel sito di taglio di Cas9 possono scomparire e le rotture del doppio filamento del DNA possono ancora essere riunite in modo efficiente”, ha detto Bao. “Questa è la prima domanda e abbiamo alcune ipotesi. Il secondo è, quali sono le conseguenze biologiche? Grandi delezioni (LD) possono raggiungere i geni vicini e interrompere l’espressione sia del gene bersaglio che dei geni vicini. Non è chiaro se le LD possano provocare l’espressione di proteine ​​troncate.

“Potresti anche avere proteine ​​​​che si ripiegano in modo errato o proteine ​​con un dominio extra a causa di inserzioni di grandi dimensioni”, ha detto. “Potrebbero succedere tutti i tipi di cose e le cellule potrebbero morire o avere funzioni anormali”.

Il suo laboratorio ha sviluppato una procedura che utilizza il sequenziamento SMRT (single-molecule, real-time) con doppi identificatori molecolari univoci (UMI) per trovare e quantificare LD non intenzionali insieme a grandi inserimenti e riarrangiamenti cromosomici locali che accompagnano piccoli inserimenti/cancellazioni (INDEL) a un sito di taglio su target Cas9.

“Per quantificare grandi modifiche genetiche, dobbiamo eseguire la PCR a lungo raggio, ma ciò potrebbe indurre artefatti durante l’amplificazione del DNA”, ha detto Bao. “Quindi abbiamo usato UMI di 18 basi come una sorta di codice a barre.”

“Li aggiungiamo alle molecole di DNA che vogliamo amplificare per identificare specifiche molecole di DNA come un modo per ridurre o eliminare gli artefatti dovuti alla PCR a lungo raggio”, ha affermato. “Abbiamo anche sviluppato una pipeline bioinformatica per analizzare i dati di sequenziamento SMRT e quantificato gli LD e gli inserimenti di grandi dimensioni”.

Lo strumento del laboratorio Bao, chiamato LongAmp-seq (per il sequenziamento di ampliconi lunghi), quantifica accuratamente sia i piccoli INDEL che i grandi LD. A differenza di SMRT-seq, che richiede l’uso di un sequencer a lettura lunga spesso disponibile solo in una struttura principale, LongAmp-seq può essere eseguito utilizzando un sequencer a lettura breve.

Per testare la strategia, il team di laboratorio guidato dall’allieva della Rice Julie Park, ora assistente professore di bioingegneria, ha utilizzato Streptococcus pyogenes Cas9 per modificare la beta-globina (HBB), la gamma-globina (HBG) e la B-celloma/leucemia 11A ( BCL11A) potenziatori nelle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) da pazienti con anemia falciforme e il gene PD-1 nei linfociti T primari.

Hanno scoperto che grandi delezioni fino a diverse migliaia di basi si verificavano ad alta frequenza negli HSPC: fino al 35,4% in HBB, 14,3% in HBG e 15,2% nei geni BCL11A, nonché sul gene PD-1 (15,2%) in T -cellule.

Poiché due degli specifici RNA guida CRISPR testati dal laboratorio Bao vengono utilizzati negli studi clinici per il trattamento dell’anemia falciforme, ha affermato che è importante determinare le conseguenze biologiche di grandi modifiche genetiche dovute alle rotture del doppio filamento indotte da Cas9.

Bao ha detto che il team di Rice sta attualmente guardando a valle per analizzare le conseguenze di lunghe delezioni sull’RNA messaggero, il mediatore che trasporta il codice per i ribosomi per produrre proteine. “Poi passeremo al livello di proteine”, ha detto Bao. “Vogliamo sapere se queste grandi delezioni e inserimenti persistono dopo che gli HSPC modificati con il gene sono stati trapiantati in topi e pazienti”

I coautori dello studio di Rice sono gli studenti laureati Mingming Cao e Yilei Fu, gli ex studenti Yidan Pan e Timothy Davis, lo specialista di ricerca Lavanya Saxena, il microscopista/specialista in biostrumentazione Harshavardhan Deshmukh e Todd Treangen, un assistente professore di informatica, e Vivien della Emory University Sheehan, professore associato di pediatria.

Bao è il presidente del dipartimento e professore di bioingegneria della famiglia Foyt, professore di chimica, scienza dei materiali e nanoingegneria e ingegneria meccanica e borsista CPRIT in ricerca sul cancro.

Il National Institutes of Health (R01HL152314, OT2HL154977) ha sostenuto la ricerca.

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Leggi l’abstract su https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abo7676.

Questo comunicato stampa può essere trovato online su https://news.rice.edu/news/2022/even-good-gene-edits-can-go-bad.

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Bao Lab: http://bao.rice.edu

Dipartimento di Bioingegneria del riso: https://bioengineering.rice.edu

George R. Brown School of Engineering: https://engineering.rice.edu

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La Rice University sta conducendo uno sforzo per rivelare potenziali minacce all’efficacia dell’editing genetico CRISPR-Cas9. Da sinistra, Julie Park, Lavanya Saxena, Mingming Cao e Gang Bao. (Credito: Jeff Fitlow/Rice University)

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I ricercatori Gang Bao e Julie Park si preparano a sequenziare un campione nel loro laboratorio della Rice University. Hanno condotto uno studio per rivelare potenziali minacce all’efficacia della modifica del gene CRISPR-Cas9 da modifiche invisibili che accompagnano le modifiche sul bersaglio. (Credito: Jeff Fitlow/Rice University)

Situata in un campus boschivo di 300 acri a Houston, la Rice University è costantemente classificata tra le prime 20 università della nazione da US News & World Report. Rice ha scuole molto rispettate di architettura, economia, studi continui, ingegneria, scienze umane, musica, scienze naturali e scienze sociali ed è sede del Baker Institute for Public Policy. Con 4.240 studenti universitari e 3.972 studenti laureati, il rapporto tra studenti universitari e docenti di Rice è di poco inferiore a 6 a 1. Il suo sistema di college residenziali crea comunità affiatate e amicizie durature, solo una delle ragioni per cui Rice è classificata n. 1 per molte interazioni razza/classe e n. 1 per la qualità della vita dalla Princeton Review. Il riso è anche valutato come il miglior rapporto qualità-prezzo tra le università private da Personal Finance di Kiplinger.


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